تست غیرتهاجمی تشخیص پیش از تولد
اختلالات کروموزومی
cell free DNA
درسال 1997 دانشمندان به وجودDNA جنین درخون زنان باردارپی بردند. این کشف مهم که با ردیابی قسمت‌هایی ازکروموزمYجنین درسرم مادرتوسط Dennis Lo صورت گرفت، اساسی شد برای ظهــور روشهای غیرتهاجمی تشخیص آنوپلوئیدی‌ها در دوران بارداری. اصـول این روش برپایه اندازه¬گیریDNA آزاد در پلاسمای مادر (cell free DNA) است که ازسلول‌های جفت آزاد می¬شوند. صاحب¬نظران، این کشف را انقلابی در علوم پرناتولوژی دانسته وپیش¬بینی می¬کنند که درآینده نزدیک تست¬های مبتنی برآن، جایگزین روش¬های رایج غربالگری گردد.
روش مولکولی غیرتهاجمی تشخیص آناپلوئیدی ها
به‌طورکلی تمرکز برنامه‌های غربالگری دوران بارداری برروی تشخیص سندرم داون، (1)NTDs و دو آنوپلوئیدی اتوزومال دیگر که کمتر شایع هستند یعنی تریزومی 18 (سندرم ادوارد) وتریزومی 13(سندرمPatau) است. سندرم داون یا تریزومی 21 شایع ترین آنوپلوئیدی درانسان با شیوع تقریباً 1 در 800 است. ریسک ابتلا جنین به سندرم داون با افزایش سن زیاد می شود، به طوری که یک خانم 45 ساله دارای ریسک 1 به 35 است. امروزه پيشرفت های علم پزشکی درمان اکثر مشکلات مبتلایان به این سندرم را امکان پذير ساخته است، به گونه ای که افراد با سندرم داون تا سنين بالا (حدود 55 سالگی) می‌توانند زندگی کنند. تریزومی های 18 و 13 نیز مانند سندرم داون در سه ماهه اول و دوم شایع تر از موقع زایمان بوده و به میزان زیادی سقط خود به خودی در آنها اتفاق می افتد. مبتلایان به تریزومی 18 و 13 دارای عمرکوتاه مدتی بوده و فقط 5 تا 10 درصد آنها تا یک سالگی زنده می مانند.
سندرم های حذفی Deletion Syndromes
سندرم های حذفی به عنوان گروهی از اختلالات قابل تشخیص بالینی محسوب می شوند که به دلیل حذف بخشی از کروموزوم ایجاد می شوند. اندازه و محل حذف، ویژگی های تظاهرات بالینی و شدت آنها را تعیین می کنند. تظاهرات بالینی می تواند شامل تاخیرات رشدی، ناتوانی های ذهنی، تفاوتهای رشدی، مشکلات رفتاری، سختی های تغذیه ای، تون عضلانی پایین، تشنج، دیسمورفی باشد.
آنوپلوئیدی های کروموزوم جنسی
آنیوپلوییدهای کروموزوم جنسی شامل اختلالات عددی در کروموزوم X و Y به صورت حذفی یا اضافه شدن هستند.اگرچه علایم بالینی مبتلایان عموما خفیف بوده و بدون ناتوانایی های ذهنی است اما بعضی ها دچار مشکلات فنوتیپی مثل اختلالات فیزیکی، تاخیر در یادگیری و ناباروری هستند.
در این تست علاوه بر جنسیت جنین آنوپلوئیدی‌های کورموزم‌های جنسی مانند سندرم ترنر نیز از هفته دهم قابل تشخیص است.
درطی دو دهه اخیر روشهای مختلفی شامل اندازه گیری مارکرهای شیمیایی و پارامترهای سونوگرافی و همچنین ترکیب این دو باهم، برای غربالگری سندرم داون ابداع شده است، اما به علت اشکالات موجود دراین روش‌ها، دانشمندان همیشه به دنبال یافتن روش‌هایی بهتر بودند. بزرگترين ايراد در روشهای سنتی غربالگری، درصد بالای نتايج مثبت و منفی کاذب و در تست‌های تأئيدی احتمال سقط جنين به علت تهاجمی بودن روش نمونه‌گيری است. درروش NIPT بدون نياز به سلول‌های بافت جفت (3)(CVS) يا نمونه‌گيری از مايع آمنيوتيک (آمنيوسنتز)، ازچند ميلي ليتر خون وريدی مادر استفاده شده و درصد موارد مثبت و منفی کاذب نيز به ميزان کمتر از 1 درصد کاهش می‌يابد.
بزرگترين ايراد روشهای سنتی غربالگری، درصد بالای نتايج مثبت و منفی کاذب است.
درسال 1997 دانشمندان به وجود DNA جنین درخون مادر پی بردند. این کشف مهم که با ردیابی قسمت‌هایی ازکروموزمY جنینی درسرم مادرتوسط Dennis Lo صورت گرفت، اساسی شد برای ظهور روشهای غیرتهاجمی تشخیص آنوپلوئیدی‌ها در دوران بارداری. اصول این روش بر پایه اندازه گیریDNA آزاد در پلاسما است که ازسلول‌های مرده جفت آزاد می‌شـوند. صاحب نظران این کشف را یک انقلاب در علوم تشخیصی می‌دانند و پیش بینی می‌کنند که در آینده نزدیک جایگزین تست‌های رایج غربالگری و تشخیص دوران بارداری گردد. بالاخره موفقیت واقعی درسال 2008 حاصل شد، زمانی که دو گروه مستقل ازمحققین با مطالعه بر روی دو جمعیت 18 و 14 تایی ازجنین‌‌های مبتلا به آنوپلوئیدی، قدرت تشخیص تریزومی‌های جنین را با استفاده از تکنیک Massively Parallel Sequencing با درستی بیشتر از 99 درصد به اثبات رساندند.
تکنیک آزمایش به این صورت است که ابتدا 50 جفت (BP)(2) از فراگمنت¬های DNA جنین در خون مادر تعیین توالی شده سپس با استفاده از محاسبات و نقشه برداری‌های بیوانفورماتیک تعداد کروموزم‌های جنین محاسبه می‌شود.
NIFTY میلیون ها قطعات DNA مادری و جنینی را در هر نمونه تعیین توالی می کند. با استفاده از تکنولوژی Next Generation Sequencing کل ژنوم و چهار آنالیز متفاوت بیوانفورماتیک اختصاصی، اطلاعات در طول کل ژنوم آنالیز شدخ و با مراجع استاندارد مقایسه می شود تا به اختلالات ژنتیکی مشخص شود.
نیمه عمر این DNA بسیار کوتاه بوده وکمتر از 2 ساعت می باشد و بلافاصله بعد از تولد از خون مادر محو می‌گردد، بنابراین بارداری‌های قبلی اختلالی درنتیجه تست ندارد. برای جلوگیری از کاهش میزان DNA خون مادر در لوله‌های حاوی ماده مخصوصی گرفته می‌شود که مقدار DNA را ثابت نگه می‌دارد. مطالعات پرجمعیت‌تری اخیراً گزارش شده است که میزان تشخیص (Detection rate) این روش را برای تریزومی 21 به میزان1/99 درصد و با ویژگی7/99 تا 9/99 درصد نشان می‌دهد.
به منظور آشنايی بيشتر با ارقام مورد بحث اگر فرض کنيم که کل موارد بارداری در ايران سالانه يک ميليون و سیصد هزار نفر باشد درصورت انجام غربالگری باروش جديدNIPT، منافع ذيل قابل دستيابی است:
1- در روش رایج تعداد بيمارانی که با نتيجه مثبت کاذب جهت انجام آزمايش تأئيدی آمينوسنتز معرفی میشوند تقریباً65000 بيمار است اما باروش NIFTY تنها 442 نفر خواهند بود. بدين معنی که سالانه بيش از64500 مورد انجام روش آمنيوسنتز کمتر درخواست می‌شود.
2- تعداد موارد سقط جنين به دليل ارجاع جهت نمونه‌گيری تهاجمی در روش اول تقریباً 650 و در روش جدید فقط 6 مورد می‌باشد.
3- موارد منفی کاذب در روش غربالگری سنتی تقریباً 325 مورد است، اما در روش جديد1 یا 2 مورد خواهد بود يعنی 323 بيمار کمتر در يک سال.
باید توجه داشت که انجام این تست، نیاز به آزمایش (AFP)(6) را برای بررسیNTDs در سه ماهه دوم از بین نبرده و خانم باردار باید حتماً درهفته‌های 15 تا 20 بارداری مجدداً به آزمایشگاه مراجعه کند.
باید توجه داشت که هنوز در مورد کسانی که نتیجه تست cell free DNA آنها مثبت (پرخطر) می‌شود باید تست تأییدی مانند CVS یا آمنیوسنتز انجام شود، ولی با توجه به درصد مثبت کاذب بسیار پایین، تعداد مواردی که نیاز به این کار می‌باشد بسیار اندک خواهد بود.
مزایای تست: غیرتهاجمی بودن، برای انجام آزمایش فقط به چندمیلی لیتر از خون مادر احتیاج است. حساسیت وصحت بالا، مطالعات بر روی جمعیت‌های بزرگ ویژگی و حساسیت بیشتر از 99 درصد را نشان داده است. تشخیص زود هنگام، آزمایش ازهفته دهم بارداری قابل انجام بوده و این زمان به تصمیم‌گیری بهتر کمک می‌کند. اگرچه تا سال 2013 اکثر تحقیقات بر روی مفید بودن این تست در مورد بارداری‌های پرخطر انجام گرفته ولی در سال 2014 دو مرکز بسیار معتبر یعنی کالج ژنتیک پزشکی امریکا (4)(ACMG) و کالج سلطنتی بیماری‌های زنان و زایمان (5)(RCOG) و همچنین پروفسور Kypros Nicolaides کاربرد NIPT را به عنوان یک تست غربالگری با حساسیت بالا پیشنهاد کرده‌اند.
تا به حال بیش از 800000 مورد تست NIFTY انجام شده است که بالاترین تعداد در بین تست های NIPT در دنیا است
مواردکاربرد:
* به عنوان یک تست مرحله دوم، در مورد کسانیکه دارای پرخطر محسوب می شوند.
1- خانم های بارداری که نتیجه تست غربالگری آنها مثبت شده است.
2- زنان با سن بیشتر از 35 سال
3- زنان بارداری که در بررسی های سونوگرافی پرخطر تشخیص داده شده اند.
4- کسانی که سابقه قبلی حاملگی با اختلالات کروموزومی دارند.
5- فردی که از طریق IVF باردار شده و یا قبلا سقط جنین تکراری داشته است.
6- مواردی که منع استفاده از تست های تهاجمی دارند مثل Placenta Parvia، کسانی که خطر سقط جنین در آنها بالا است و افراد مبتلا به عفونت هپاتیت B.
* به عنوان یک تست غربالگری باقدرت تشخیص بسیار بالا، برای کسانی که نمی‌خواهند میزان ریسک منفی کاذب، در روشهای رایج غربالگری را بپذیرند. * یک انتخاب به عنوان یک تست تأییدی برای زنانی که قادر به پذیرش خطر روشهای تهاجمی نیستند، و یا از نحوه نمونه‌گیری در روشهای تهاجمی وحشت دارند. * یک انتخاب برای مواردی که کشت سلولی با شکست مواجه می‌شود.
پیشنهادات: 1- خانم‌های باردار باید قبل از تصمیم‌گیری در مورد انتخاب روش مورد استفاده برای غربالگری و یا تأیید نتیجه مثبت (پرخطر) در روشهای رایج غربالگری، مورد مشاوره قرار گرفته و از مزایا و معایب همه روشهای موجود مطلع گردند. 2- کاربرد این تست برای کسانیکه از نحوه نمونه گیری روشهای تهاجمی وحشت دارند. 3- انجام تستNIPT برای زنانی که نمی توانند خطر سقط در روشهای تهاجمی را بپذیرند مانند زنانی که پس از درمان‌های طولانی و پرهزینه و یا در سنین بالا باردار شده‌اند.
منابع
br />1-Glenn E. Palomaki, CosminDeciu, Edward M. Kloza, Geralyn M. Lambert-Messerlian, DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as down syndrome: an international collaborative study, Genetics in medicine ,Volume 14, Number 3, March 2012
2-Peter Benn, AntoniBorrell, Howard Cuckle, Lorraine Dugoff, Susan Gross, Prenatal Detection of Down Syndrome using Massively Parallel Sequencing (MPS): Prenatal Diagnosis, 24 October 2011
3-Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, Tynan JA, Cagasan L, Tim R, Lu V, et al. Noninvasive detection of fetal Trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting. Am J Obstet.Gynecol 2011;204:205.e1–205.11.
4-Chiu RW, Akolekar R, Zheng YW, Leung TY, Sun H, Chan KC, Lun FM, et al. Non-invasive prenatal assessment of Trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ 2011;342:c7401.
5-Ashoor, G., Syngelaki, A., Wagner, M., Birdir, C., Nicolaides, K.H., Chromosome-selective sequencing of maternal plasma cell-free DNA for first trimester detection of trisomy 21 and trisomy 18, Am J Obstet Gynecol. (2012), doi: 10.1016/j.ajog.2012.01.029.
6-Chiu RWK, Akolekar R, Zheng YWL, et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. Brit Med J. 2011;342:c7401
7-Sparks, A.B., Struble, C.A., Wang, E.T., Song, K., Oliphant, A., Non-invasive Prenatal Detection and Selective Analysis of Cell-free DNA Obtained from Maternal Blood: Evaluation for Trisomy 21 and Trisomy 18, Am J Obstet Gynecol. (2012), doi: 10.1016/j.ajog.2012.01.030.
8-RossaWK Chiu, RanjitAkolekar, YamaWLZheng, Tak Y Leung, Hao Sun..., Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scalevailidity study, BMJ 2011;342:c7401
9.TzeKinLau,Fang Chen, Xiaoyu Pan, Ritsuko K . Pooh, Fuman Jiang, YihanLi, Hui Jiang, Xuchao, Li,Shengpei Chen &Xiuqing Zhang, Noninvasive prenatal diagnosis of common fetal chromosomal aneuploidies by maternal plasma DNA sequencing, Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 2012
10-Shan Dan.,Fang Chen.,KwongWaichoy.,Fuman Jiang, Jingrong Lin, ZhaolingXuan, Wei Wang, Shengpei Chen, Xuchao Li ..., Prenatal Detection of Aneuploidy and Imbalanced Chromosomal Arrangements by Massively Parallel Sequencing, PLoS ONE, February 2012, Volume 7, lssue 2
11-Non Invasive Prenatal Testing for chromosomal abnormality using maternal plasma DNA. Scientific Impact Paper No. 15, March 2014 12-ACMG statement on noninvasive prenatal screeningfor fetal aneuploidy.Anthony R. Gregg, S.J. Gross, R.G. Best, K.G. Monaghan, K. Bajaj, B.G. Skotko,Genet Med advance online publication 4 April 2013
پانوشت
1. Neural Tube Defects
2. Basic Pair
3. Chorionic Villus Sampling
4. American College of Medical Genetics and Genomics
5. Royal College of Obstetrics & Gynecology
6. Alpha Feto Protein
7. American Collage of meical Genetic and Genomics
8. Royal Collage of Obstetrics & Gynecology
